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都正学院 | “蛋白置换法”结合ICP-MS检测尿液中银离子浓度

都正学院 | “蛋白置换法”结合ICP-MS检测尿液中银离子浓度

  • 分类:学术干货
  • 作者:
  • 来源:
  • 发布时间:2020-08-07
  • 访问量:0

都正学院 | “蛋白置换法”结合ICP-MS检测尿液中银离子浓度

  • 分类:学术干货
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摘要:

      通过“蛋白置换法”,可以分步实现尿液中银离子的解聚和解吸附,有效解决银离子非特异性吸附和严重残留的难题,提高生物基质中金属离子的提取效率,改善ICP-MS在金属离子药物中的药代动力学检测应用。
  

 前处理是检测金属离子的关键

      银离子药物的杀菌机理,是通过游离的Ag+结合细胞等微生物中蛋白质的自由疏基(可逆结合),改变蛋白表面电荷,使蛋白质变性而凝固,破坏细胞合成酶活性,细胞因丧失分裂增殖能力而死亡。

      大部分银离子药物的使用浓度趋近于痕量(低至μg/ml或ng/ml),无疑对银离子浓度的检测灵敏度和准确性提出了挑战。电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)是检测银离子等金属离子的首选,常应用于土壤、化妆品、水体、农作物、食品等基体干扰较低的基质中,如何有效的排除或降低尿液、血浆等生物基质中的银离子检测干扰,是开发相关检测方法必须解决的问题。

      以尿液这类水溶液基质来说,它含有大量水分,少量无机盐、尿素、尿酸等,以及含量很低的蛋白质和葡萄糖。在碱性尿液中,带正电荷的银离子极易吸附在表面带负电荷的容器上(如玻璃、聚丙烯或聚苯乙烯),普通超声处理和微波消解难以有效解除吸附。此外,由于胆汁排泄是消除银的主要方式,而不是经肾排泄,如需从尿液中检测到银,需要前处理方法非常高效的富集极低浓度银离子。

      当前的消解法等前处理方法主要局限在于:

      ①处理方法简单,多采用硝酸一步直接稀释,或增加固相萃取,但是银离子极易吸附在管壁或者萃取柱上,解吸附效果差;

      ②解吸附的银离子在富集过程中,易再次发生吸附而损失,次而产生残留效应,难以适用于银离子药物的定量研究。因此,开发一种改进的生物基质中银离子富集方法具有现实意义。

 

“蛋白置换法”前处理方法原理

      基于上述的尿液中银离子富集难题,都正生物分析测试中心技术团队开发了“蛋白置换法”前处理方法,利用蛋白-银离子螯合物的聚合能力强于银离子与管壁的非特异性吸附能力,同时,该螯合物又可以通过pH的改变实现聚合和解聚,实现对生物基质中银离子进行高效富集,相关原理见下图。实施过程包括:

      1)尿液样本与少量稀硝酸经一定比例混合,改变尿液的pH值为弱碱性或中性,解吸附容器管壁上的大部分银离子;

      2)加入一定量蛋白溶液,利用蛋白与银离子等金属物质在弱碱性或中性环境下的吸附作用力,远大于容器管壁与银离子吸附作用力的特征,1个蛋白分子可结合n个银离子,置换结合容器管壁上、部分游离在溶液中的银离子,形成蛋白-银离子螯合物;

      3)加入适当倍率的稀硝酸,改变尿液的pH为酸性,解聚蛋白-银离子螯合物,形成类似硝酸银之类的易溶解型硝酸盐,解离后的蛋白还可依靠空间位阻来阻断银离子与管壁的再吸附,获得全部游离型银离子;

      4)采用适当分离技术,将存在于倍率稀硝酸体系的游离型银离子转移到低吸附容器中,进样检测。

 ▲ “蛋白置换法”原理

 

方法准确度和精密度验证

      对5种浓度质控品通过2天连续3批前处理,结合ICP-MS验证本方法检测尿液中银离子浓度的准确度(回收率)和精密度(重复性)。结果表明:5个不同浓度银质控品,各重复测定6次的准确度偏差不超过标示值的-2.61%~5.23%,均符合±15%之内的接受标准;各浓度下的银质控品,6次测量结果批内、批间精密度CV%在0.76%~1.93%,均符合≤15%的接受标准,验证了本方法的准确度和精密度符合PK定量要求。

 

小结

      都正生物分析测试中心利用银离子在pH为弱碱性或中性时与蛋白的结合力更强于与容器管壁的结合力,蛋白-银离子等金属螯合物在碱性下结合、在酸性条件下完全解离的原理,摸索出“蛋白置换法”,有效解决了尿液中银离子测不准,难重复的问题,方法验证合格。

      目前,相关方法已形成技术专利且应用到实际样本PK定量研究,同时结合临床试验联盟、自主开发的LIMS信息化系统和严谨的数据统计团队等自身优势资源,更好的服务于临床评价,欢迎咨询合作。

 

参考文献

[1] Lin YS, Rothen ML, Milgrom P.Pharmacokinetics of 38% topical silver diamine fluoride in healthy adult volunteers [J].J Am Dent Assoc,2019,150(3):186-192

[2] 长沙都正生物科技有限责任公司,一种生物基质中银离子富集方法、定量试剂盒及检测方法[P],2020105001519

 

作者:侯利平

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